Теперь можно создавать сложные, специально разработанные трансмембранные белки с нуля, сообщают ученые. Исследование, проведенное молекулярными инженерами из Университета «Washington Institute for Protein Design», позволит исследователям создавать трансмембранные белки, не встречающиеся в природе, для выполнения конкретных задач.
В живом мире трансмембранные белки обнаружены в мембране всех клеток и клеточных органелл. Они необходимы для нормальной работы. Например, многие естественные трансмембранные белки действуют как шлюзы для перемещения конкретных веществ через биологическую мембрану. Некоторые трансмембранные белки принимают или передают сигналы клеток. Из-за таких ролей многие препараты предназначены для нацеливания трансмембранных белков и изменения их функций.
«Наши результаты прокладывают путь для разработки мембранных белков, которые могут имитировать протеины, обнаруженные в природе, или иметь совершенно новую структуру, функцию и использование», — сказал Дэвид Бейкер, профессор биохимии, который возглавлял проект. Исследование публикуется в номере журнала Science за 1 марта. Пейлонг Лу, старший научный сотрудник лаборатории Baker, является ведущим автором статьи.
Но понимание того, как трансмембранные белки объединяются и как они работают, оказалось сложным. Поскольку они действуют, будучи встроенными в клеточную мембрану, трансмембранные белки оказались более трудными для изучения, чем белки, которые действуют в водном растворе, которые составляют цитоплазму клеток или внеклеточную жидкость.
В новом исследовании Лу и его коллеги использовали компьютерную программу, разработанную в лаборатории Бейкера и названную Rosetta, которая может предсказать структуру, в которую белок будет складываться после того, как он был синтезирован. Архитектура белка имеет решающее значение, так как структура белка определяет его функцию.
Форма белка образуется из сложных взаимодействий между аминокислотами, составляющими белковую цепь, и взаимодействий между аминокислотами и окружающей средой. В конечном счете, белок принимает форму, которая наилучшим образом уравновешивает все эти факторы, так что белок достигает наименьшего возможного энергетического состояния.
Программа Rosetta, используемая Лу и его коллегами, может предсказать структуру белка, принимая во внимание эти взаимодействия и рассчитывая самое низкое общее энергетическое состояние. Она создает десятки тысяч модельных структур для аминокислотной последовательности, а затем идентифицирует те, которые имеют низкое энергетическое состояние.
Определение структуры трансмембранных белков затруднено, потому что части трансмембранных белков должны проходить через внутреннюю часть мембраны, которая состоит из жиров, называемых липидами.
В водных жидкостях аминокислотные остатки, которые имеют полярные боковые цепи — компоненты, которые могут иметь заряд в определенных физиологических условиях или которые участвуют в водородных связывания, как правило, расположены на поверхности белка, где они могут взаимодействовать с водой, которая имеет отрицательные и положительно заряженные стороны его молекулы. В результате полярные остатки на белках называются гидрофильными или «водолюбивыми».
С другой стороны, неполярные остатки, как правило, находятся в пределах ядра белка. Такие остатки называются гидрофобными. В результате, взаимодействие между водолюбивыми и водоудерживающими остатками белка и окружающих водных жидкостей помогает сгибать белки и стабилизирует окончательную структуру белка.
Однако в мембранах сложность белка больше, поскольку внутренняя поверхность липидов мембраны неполярна, то есть она не имеет разделения электрических зарядов. Это означает, что белок должен быть устойчивым, и на его поверхности должны быть размещены неполярные, опасные для воды остатки, а полярные должны быть внутри. Затем нужно найти способ стабилизировать структуру, создав связи между гидрофильными остатками в ядре.
Ключом к решению проблемы, говорит Лу, было применение метода, разработанного лабораторией Бейкера для создания белков, чтобы полярные, гидрофильные остатки действовали таким образом, чтобы было достаточно сформировать полярно-полярные взаимодействия, которые могли бы связать белок вместе изнутри.
«Объединение этих «замкнутых сетей водородной связи» было похоже на сборку головоломки с пистолетом», — сказал Бейкер.
При таком подходе Лу и его коллеги смогли изготовить сконструированные трансмембранные белки внутри бактерий и клеток млекопитающих с использованием всего 215 аминокислот. Полученные белки оказались очень термически стабильными и способными правильно ориентироваться на мембране. Подобно природным трансмембранным белкам, эти белки являются многопроходными, то есть они несколько раз пересекают мембрану и собираются в стабильные многобелковые комплексы, такие как димеры, тримеры и тетрамеры.
«Мы показали, что теперь можно точно сконструировать сложные, многопроходные трансмембранные белки, которые могут находится в клетках, что позволит исследователям создавать трансмембранные белки с совершенно новыми структурами и функциями», — сказал Пейлонг Лу.
Больше информации: «Accurate computational design of multipass transmembrane proteins» Science (2018). DOI: 10.1126/science.aaq1739
Образование трансмембранных белков должно включать этапы узнавания трансмембранных доменов и их интеграцию в липидный бислой
Трансмембранные домены выходят из транслокона в латеральном направлении через белок-липидную поверхность раздела
Позиционирование на транслокационном канале и начало переноса секреторных и трансмембранных белков происходят одинаково. Однако транслокация мембранных белков должна сочетаться с их интеграцией или вставкой в липидный бислой ЭПР. Интеграция происходит в тот момент, когда трансмембранные домены узнаются транслоконом, тогда их транслокация в просвет ЭПР прекращается, и они начинают переноситься из канала в липидный бислой в латеральном направлении. Таким путем синтезируются и интегрируются много различных типов трансмембранных белков, включая те, которые пронизывают мембрану несколько раз.
Первым шагом на пути интеграции белка в мембрану является узнавание трансмембранных доменов транслоконом. Эти домены простираются на расстояние около двадцати гидрофобных аминокислот. Из-за своего гидрофобного характера некоторые трансмембранные домены узнаются SRP как сигнальные последовательности. Эти так называемые сигнальные якорные последовательности вначале позиционируют новообразующийся белок на ЭПР, а затем направляются в канал как обычные сигнальные последовательности.
Однако сигнальные якорные последовательности не отщепляются от белка, а интегрируются в мембрану. Как показано на рисунке ниже, в отличие от сигнальной якорной последовательности, большинство трансмембранных доменов узнаются транслоконом, как только они сошли с рибосомы, после завершения адресования с помощью обычной N-терминальной сигнальной последовательности. Информация о том, что трансмембранный домен уже синтезировался, должна передаваться на транслокон другим путем, отличным от переноса с SRP.
Сигнальные якорные последовательности переносятся непосредственно от SRP на транслокон,однако узнавание внутренних трансмембранных доменов должно происходить по мере их высвобождения из рибосомы.
Самый простой признак , свидетельствующий о том, что трансмембранный домен находится в транслоконе, это гидрофобность самого домена. Из-за особенности структуры транслокационный канал обнаруживает эту гидрофобность. Как показано на рис. 3.21, структура транслокона предполагает, что канал способен открываться подобно раковине моллюска, что позволяет трансмембранному домену одновременно контактировать с каналом и с липидным бислоем. По-видимому, сигнальные последовательности и трансмембранные домены связываются с белком Sec61a, расположенным со стороны открывающихся створок, и это связывание затем вызывает латеральное открытие канала.
Такая схема предложена на основании экспериментальных данных , согласно которым трансмембранные домены в канале контактируют с Sec61a и . В результате, хотя в составе транслокона находится водный канал, в мембране присутствует достаточно гидрофобных каналов, в которых перемещаемые полипептиды могут попасть в окружение липидов. Следует ожидать, что участки, содержащие полярные аминокислоты, должны продвигаться через канал без остановки, в то время как гидрофобные домены за счет сильного взаимодействия с липидами будут оставаться связанными с боковыми стенками канала, препятствуя транслокации.
В некоторых случаях транслокон может по-другому идентифицировать трансмембранный домен. Например, иногда в процессе синтеза трансмембранного домена изменения во взаимодействии между рибосомой и транслоконом происходят до того момента, как домен сошел с рибосомы. Эти изменения служат для транслокона сигналом о скором появлении трансмембранного домена. Каким образом трансмембранный домен вызывает изменения в рибосоме и передает их транслокону, остается невыясненным. Иногда для узнавания также необходимы полярные элементы новообразующейся цепи, примыкающие к трансмембранному домену. Это позволяет предположить, что, по крайней мере, в некоторых случаях процесс узнавания должен включать нечто большее, чем просто гидрофобное взаимодействие между доменом и канально-липидным окружением.
Граница канала и липидного слоя , по-видимому, служит путем выхода трансмембранных доменов из канала после их узнавания. Однако механизм выхода домена из транслокона несколько варьирует от субстрата к субстрату. Некоторые домены покидают транслокон почти сразу после узнавания их в канале. В этих случаях трансмембранный домен сначала контактирует с Sec61a и с липидами, а затем только с липидами; при этом предполагается, что домен уже проник в липидный бислой.
Для интеграции таких доменов других белков , за исключением комплекса Sec61, не требуется. Другие трансмембранные домены интегрируются более медленно и после узнавания долго не выходят из транслокона, иногда даже оставаясь там до окончания трансляции. По мере выхода из канала в бислой эти трансмембранные домены вступают в контакт с белком TRAM, хотя его дальнейшая роль остается пока неясной.
Степень гидрофобности частично определяет, интегрируется ли трансмембранный домен сразу же, или это происходит на более позднем этапе синтеза белка. Более гидрофобные домены могут быстрее продвигаться в липидный бислой, но менее гидрофобные могут оставаться на границе, и им необходимы дополнительные транспортные факторы. Не исключено, что TRAM и другие белки служат шаперонами для некоторых трансмембранных доменов. Они способствуют интеграции таких доменов, гидрофобность которых оказывается недостаточной для перемещения.
Очевидно, что по крайней мере группа трансмембранных белков может представлять собой множественные формы, содержащие определенный домен, который в одних случаях интегрируется в мембрану, а в других остается неузнанным. Такие белки, как TRAM, могут определять, при каких условиях такие замены будут интегрированы.
Транслокон изображен в виде цилиндра,
который открывается и закрывается двумя способами,
позволяющими движение новообразующейся цепи через пору и продвижение в мембрану трансмембранного домена.
Промежуток в стенке канала транслокации позволяет белкам поступать в липидный бислой,
а также узнавать и встраивать трансмембранные домены.
Поскольку домены обладают гидрофобными свойствами, они предпочитают липидное окружение и мигрируют из канала в липидный бислой.
Клетки. Связывание с сигнальной молекулой (гормоном или медиатором) происходит с одной стороны от мембраны, а клеточный ответ формируется на другой стороне от мембраны. Таким образом, они играют уникальную и важную роль в межклеточных связях и передаче сигнала.
Многие трансмембранные рецепторы состоят из двух или нескольких субъединиц, которые действуют в совокупности и могут диссоциировать при связывании с лигандом или менять свою конформацию и переходить на следующую стадию цикла активации. Зачастую они классифицируются на основе их молекулярной структуры. Полипептидные цепи простейших из этих рецепторов пересекают липидный бислой лишь один раз, между тем как многие - семь раз (например, связанные с G-белками рецепторы).
Строение
Внеклеточный домен
Внеклеточный домен - это участок рецептора, который находится вне клетки или органоида. Если полипептидная цепь рецептора пересекает клетку несколько раз, то внешний домен может состоять из нескольких петель. Основная функция рецептора состоит в том, чтобы опознавать гормон (хотя некоторые рецепторы также способны реагировать на изменение мембранного потенциала), и во многих случаях гормон связывается именно с этим доменом.
Трансмембранный домен
Некоторые рецепторы являются также и белковыми каналами. Трансмембранный домен в основном состоит из трансмембранных α-спиралей. В некоторых рецепторах, таких как никотиновый ацетилхолиновый рецептор, трансмембранный домен формирует мембранную пору или ионный канал. После активации внеклеточного домена (связывания с гормоном) канал может пропускать ионы . У других рецепторов после связывания гормона трансмембранный домен меняет свою конформацию, что оказывает внутриклеточное воздействие.
Внутриклеточный домен
Внутриклеточный, или цитоплазматический, домен взаимодействует с внутренней частью клетки или органоида, ретранслируя полученный сигнал. Существуют два принципиально разных пути такого взаимодействия:
- Внутриклеточный домен связывается с эффекторными сигнальными белками, которые в свою очередь передают сигнал по сигнальной цепи к месту его назначения.
- В случае если рецептор связан с ферментом или сам обладает ферментативной активностью, внутриклеточный домен активирует фермент (или осуществляет ферментативную реакцию).
Классификация
Большинство трансмембранных рецепторов относится к одному из трёх классов, выделяемых по основному механизму трансдукции сигнала. Классифицируют ионотропные и метаботропные трансмембранные рецепторы. Ионотропные рецепторы, или рецепторы, сопряжённые с ионными каналами, участвуют, например, в быстрой передаче синаптических сигналов между нейронами и другими клетками-мишенями, которые могут воспринимать электрические сигналы.
Метаботропные рецепторы передают химические сигналы. Они подразделяются на два больших класса: рецепторы, сопряжённые с G-белками , и рецепторы, сопряжённые с ферментами .
Рецепторы, сопряжённые с G-белками, также называются 7TM-рецепторами (seven-transmembrane domain receptors, рецепторы с семью трансмембранными доменами). Это трансмембранные белки с внешним сегментом для связывания лиганда, мембранным сегментом и цитозольным сегментом, связанным с G-белком. В них выделяют шесть классов на основании подобия структуры и функций рецепторов, классы A-F (или 1-6), которые, в свою очередь, подразделяются на множество семейств. К этому классу относятся рецепторы органов чувств и адренорецепторы .
Как и GPCR, рецепторы, сопряжённые с ферментами - это трансмембранные белки, у которых домен связывания с лигандом расположен снаружи мембраны. В отличие от GPCR, их цитозольный домен не сопряжён с G-белком, а сам обладает ферментативной активностью или связывает фермент напрямую. Обычно вместо семи сегментов, как у GPCR, такие рецепторы имеют только один трансмембранный сегмент. Эти рецепторы могут включать те же сигнальные пути, что и GPCR. К этому классу относится, например, инсулиновый рецептор.
Выделяют шесть основных классов рецепторов, сопряжённых с ферментами:
- Рецепторные тирозиновые киназы - могут непосредственно фосфорилировать тирозиновые остатки, как собственные, так и для небольшого набора внутриклеточных сигнальных белков.
- Рецепторы, сопряжённые с тирозинкиназами - сами по себе не является активными ферментами, но непосредственно связывают цитоплазматические тирозинкиназы для передачи сигнала.
- Рецепторные серин-треониновые киназы - могут непосредственно фосфорилировать сериновые или треониновые остатки, как собственные, так и для белков регуляции генов, с которыми они связываются.
- Рецепторы, связанные с гистидиновыми киназами - активируют двухстадийный сигнальный путь, в котором киназа фосфорилирует собственный гистидин и немедленно передаёт фосфат второму внутриклеточному сигнальному белку.
- Рецепторные гуанилатциклазы - прямо катализируют производство молекул цГМФ в цитозоле, которые действуют как небольшой внутриклеточный посредник по механизмам, во многом схожим с цАМФ.
- Рецептороподобные тирозинфосфатазы - удаляют фосфатные группы с тирозинов внутриклеточных сигнальных белков. Они называются рецептороподобными, потому что механизм их действия как рецепторов остается невыясненным.
Регуляция
В клетке существует несколько путей регуляции активности трансмембранных рецепторов, наиболее важными способами являются фосфорилирование и интернализация рецепторов.
См. также
Примечания
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "Трансмембранные рецепторы" в других словарях:
Ацетилхолин Холинэргические рецепторы (ацетилхолиновые рецепторы) трансмембранные рецепторы, лигандом которых является ацетилхолин … Википедия
Трансмембранные рецепторы мембранные белки, которые размещаются и работают не только во внешней клеточной мембране, но и в мембранах компартментов и органелл клетки. Связывание с сигнальной молекулой (гормоном или медиатором) происходит с одной… … Википедия - Нейропилин 1 Обозначения Символы NRP1 Entrez Gene … Википедия
Димер комплекса сенсорного родопсина II и белка трансдьюсера. Сенсорный родопсин изображен голубым. Вид в плоскости мембраны. Сенсорный родопси … Википедия
Действующее вещество ›› Хориогонадотропин альфа* (Choriogonadotropin alfa*) Латинское название Ovitrelle АТХ: ›› G03GA08 Хориогонадотропин альфа Фармакологическая группа: Гормоны гипоталамуса, гипофиза, гонадотропины и их антагонисты… … Словарь медицинских препаратов
Протеинкиназа А протеинкиназа, активность которой зависит от уровня цАМФ в клетке. Протеинкиназа А осуществляет активацию и инактивацию ферментов и других белков за счёт фосфорилирования (то есть присоединения фосфатной группы). Содержание… … Википедия
Протеинкиназа А протеинкиназа, активность которой зависит от уровня цАМФ в клетке. Протеинкиназа А осуществляет активация и инактивация ферментов и других белков за счёт фосфорилирования (то есть присоединения фосфатной группы). Содержание 1… … Википедия
4. "Рositive inside"
Чтобы проверить правило "positive inside" с 3D-гомологом, я выделил синим положительно заряженные атомы азота аргинина и лизина (гистидином принебрег) и красным отрицательные кислороды аспартата и глутамата в программе Pymol. Если по рисунку кажется, что правило не выполняется, это иллюзия. На самом деле, на внутренней стороне 810 положительных и 660 отрицательных атомов - очевино, что внутри большой плюс (особенно если еще присовокупить гистидины). На внешней стороне - нуль: равное количество противозарядов. Заметно, что в толще мембраны вообще нет заряженных остатков.
5. Транс-мембранный бета-баррель у грам-положительных бактерий
Mycobacterium smegmatis - грам-положительная бактерияПорин MspA, 1UUN
Селективен по отношению к катионам благодаря высокой плотности отрицательного заряда на поверхности. Также транспортирует
глюкозу, серин, гидрофильные бета-лактамы и пр.
Существует два отличия от бета-баррелей грам-отрицательных бактерий:
6. Альфа-спиральныйбелок во внешней мембране грам-отрицательных бактерий
Helicobacter pylori - грам-отрицательная бактерияTrbI-подобный белок конъюгации, 2BHV
Белок, участвующий в конъюгации бактерий, при которой происходит обмен генетической информацией между двумя особями.
8. Сервисы, предсказывающие трансмембранные бета-баррели по последовательности
Было предсказано наличие 9 стрэндов, когда их в действительности 8 (не зная структуры гомолога, я говорю "в действительности", так как судя по выравнванию структура у гомолога такая же, как и у исходного белка). Пять стрэндов совпало с исходным.
В общем, предсказание сделано верно, хотя хотелось бы более точно.
Выравнивание с разметкой
1. Увеличить клетку до размеров дыни и сказать, с чем можно сравнить мембрану
Размер клетки в 1000 раз больше толщины мембраны. 30 сантиметров дыни поделить на 1000, получим доли миллиметра. Такую толщину имеет алюминиемая фольга, например, или - из биологии - кутикула на поверхности листа или той же самой дыни.Принципы структурной организации мембранных белков и способы ее предсказания для трансмембранных белков
С высоким разрешением удалось установить структуру только одного класса мембранных белков - реакционного центра бактерий, однако и в этом случае положение белка относительно липидного бислоя не определено однозначно. Распространять принципы его организации на другие мембранные белки следует с осторожностью. Некоторую ясность может внести использование термодинамических принципов, а также учет того факта, что основная масса экспериментальных данных согласуется с предположением о высоком содержании в мембранных белках а-спиралей. Термодинамические факторы налагают определенные ограничения на то, какого типа белково-липидные структуры могут быть стабильными.
Мембранные белки - это амфифильные соединения
Любые мембранные белки, непосредственно контактирующие с гидрофобной сердцевиной липидного бислоя, должны быть амфифильными. Те участки полипептида, которые экспонированы в растворитель, скорее всего обогащены полярными и ионизируемыми аминокислотными остатками, а остатки, контактирующие с лилидными углеводородными цепями, должны быть в основном неполярными. Все это логически следует из энергетических принципов, рассмотренных в разд. 2.3.1. Заряженные или полярные аминокислоты вообще говоря могут находиться внутри бислоя, однако на это налагаются определенные ограничения.
Рассмотрим три уровня амфифильных структур в мембранных белках: первичную, вторичную и третичную амфифильность.
1. Первичные амфифильные структуры содержат протяженный участок из преимущественно неполярных аминокислотных остатков, длина которого достаточна для пересечения бислоя. Такие структуры выявлены как в реакционном центре, так и в бактериородопсине. У этих белков все пронизывающие мембрану элементы являются а-спиральными. а-Спиральная структура предпочтительна потому, что при этом образуются все водородные связи, в которых могут участвовать атомы водорода полипептидного каркаса. Альтернативная структура, у которой отсутствует одна из водородных связей, менее стабильна примерно на 5 ккал / моль. Все это позволяет высказать предположение о том, что поворот полипептидной цепи внутри мембраны маловероятен. В местах поворота от трех до пяти аминокислотных остатков не смогли бы образовать водородные связи, и это дестабилизировало бы структуру примерно на 15-20 ккал / моль. В глобулярных, водорастворимых белках области поворота располагаются преимущественно на поверхности белковой глобулы, где амидные группы могут образовывать водородные связи с водой; по-видимому, в молекулах мембранных белков повороты также будут происходить лишь в экспонированных в воду участках.
Не исключено, что 3-слой тоже может образовывать трансмембранные элементы, имеющие, например, форму /J-цилиндров, как в случае порина. Требования, предъявляемые к образованию водородных связей атомами водорода полипептидного остова в подобных структурах, могут быть удовлетворены, но лишь при условии взаимодействия между отдельными ^-цепями. Как такая структура может встраиваться в мембрану, не совсем ясно, а ограничения, налагаемые механизмами сборки мембранных белков, вообще неизвестны.
2. Вторичные амфифильные структуры. В таких структурах гидрофобные остатки периодически встречаются вдоль цепи, и при укладке полипептида в определенную вторичную структуру они образуют сплошную поверхность. Периодичность некоторых элементов вторичной структуры указана в табл. 1. В качестве примера белков, в которых вторичные амфифильные структуры, по-видимому, играют важную роль, можно привести порины. В них полярные и неполярные аминокислотные остатки в каждой из /3-цепей чередуются. Все полярные остатки находятся на одной стороне складчатого слоя, выстилая наполненную водой пору. Заметим, что все сказанное о порине носит гипотетический характер.
Таблица 1. Параметры вторичной структуры
|
Структура |
Периодичность или число остатков на виток |
Расстояние между остатками, А |
Радиус или ширина, А |
|
Неизогнутая |
|||
|
(З-цепь |
|||
|
Изогнутая /З-цепь |
|||
|
Зю-Спираль |
|||
|
а-Спираль |
а-спираль, в которой гидрофобные остатки встречаются через каждую вторую или третью мономерную единицу, должна иметь гидрофобную и полярную поверхности. Подобные структуры часто представляют в виде спирального кольца с указанием боковых цепей - так, как это сделано на рис. Вторичные амфифильные структуры могут возникать в ситуациях, схематически показанных на рис. ЗЛО.
а. Поверхностно-активные сегменты белка; одна сторона спирали взаимодействует с гидрофобной областью липидного бислоя, а другая контактирует с водной фазой и полярной областью бислоя. Амфифильные а-спирали способны образовывать многие пептидные гормоны, а также разрушающие мембрану пептиды, например меллитин.
б. Трансмембранные элементы; неполярная поверхность спирали обращена к липидной фазе, а полярная выстилает водный канал, пронизывающий бислой. Это весьма распространенная модель, построенная главным образом исходя из результатов исследования никотинового ацетилхолинового рецептора, функционирующего как химически возбудимый канал. Однако основанные на экспериментальных данных выводы о том, что мембрану пронизывает именно амфифильная спираль, вызвали возражения. Такой наполненный водой канал, как в порине, может образовать и амфифильная 3-цепь.
в. Трансмембранные элементы; неполярная часть поверхности контактирует с липидами, а полярные группы - с полярными группами других трансмембранных элементов. Именно этот принцип лежит в основе «вывернутых» структур, каким предположительно является бактериородопсин. Полярные взаимодействия между амфифильными спиралями в принципе могли бы стабилизировать взаимодействия между субъединицами в олигомерных белках.
3. Третичные амфифильные структуры. Об их существовании можно говорить только предположительно. Их гидрофобная поверхность должна формироваться на уровне третичной структуры остатков, расположенных в самых разных участках полипептидной цепи. Подобные структуры могут быть характерны для белков, связывающихся с бислоем, но не имеющих четко выраженных гидрофобных доменов, определяемых по любому из указанных выше критериев. Возможным примером такого рода является а-лактальбумин.
Ионизируемые аминокислотные остатки в трансмембранных сегментах
Многие модели мембранных белков предполагают, что в их трансмембранных сегментах находятся ионизируемые остатки. Эти остатки, вероятно, играют важную функциональную и / или структурную роль. В некоторых случаях эта роль однозначно установлена: 1) остатки лизина в бактериородопсине и родопсине образуют шиффовы основания с простетической группой ретиналя, что необходимо для светового возбуждения молекулы; 2) остатки гистидина в полипептидах реакционного центра бактерий участвуют в связывании с фотосинтетическими пигментами; 3) заряженные остатки в лактозопермеазе из Е. coli участвуют в осуществлении этим белком транспортных функций; возможно, эти остатки образуют сеть водородных связей внутри молекулы белка.
Перенос заряженных групп из воды в среду с низкой диэлектрической проницаемостью внутри мембраны энергетически очень невыгоден, и эти группы необходимо каким-либо образом стабилизировать. Неоднократно предполагалось, что для стабилизации достаточно образования ионных пар, и этот принцип использовался при построении трехмерной модели бактериородопсина. Однако расчеты показали, что свободная энергия переноса ионной пары из воды в среду с низкой диэлектрической проницаемостью тоже весьма велика. Для дальнейшей стабилизации необходимы дополнительные полярные взаимодействия, возможно, с участием других полярных групп или с помощью водородных связей.
В принципе даже одиночная заряженная группа внутри мембраны может стабилизироваться через взаимодействия с полярными группами и при участии водородных связей, эффективно делокализующих заряд. Можно привести несколько примеров изолированных, де-сольватированных ионов, стабилизированных за счет взанмодействий в водорастворимых белках. Аналогичные принципы, по-видимому, действуют в случае заряженных остатков трансмембранных сегментов интегральных белков.
Однако представляется более вероятным, что ионизируемые аминокислоты нейтрализуются внутри мембраны за счет протонирования или депротонирования. Свободная энергия нейтрализации заряженных аминокислот, по оценкам, составляет примерно 10-17 ккал / моль. В отсутствие специфических условий для полярных взаимодействий, стабилизирующих заряженный остаток в трансмембранном сегменте, он скорее всего будет нейтрализован.
Заряженные аминокислоты в сегментах, экспонированных в водную среду
Как мы уже говорили, заряженные остатки распределены между двумя сторонами реакционного центра бактерий асимметрично. Такая асимметрия характерна и для некоторых других внутренних мембранных белков бактерий. Так, основные остатки Lys и Arg в четыре раза чаще встречаются в тех соединяющих трансмембранные элементы участках, которые расположены на внутренней стороне мембраны, а не на наружной. Для кислых остатков Asp и Glu подобная тенденция не выявляется. Возможно, эта асимметрия связана с механизмом сборки мембранного белка, но как именно - неясно. Более того, неизвестно, можно ли обобщить это наблюдение и имеет ли оно какую-либо предсказательную ценность.
В глобулярных, водорастворимых белках остатки пролина редко находятся в серединной части а-спирали. По данным исследований 58 белков, содержащих 331 а-спираль, выявлено 30 таких случаев. В половине из них пролин располагался в местах повреждения спирали, а в остальных случаях находился в области искривления или нерегулярности структуры.
В то же время у бактериородопсина пролиновые остатки расположены в средней части трех из семи трансмембранных спиралей, а у родопсина - в пяти из семи таких спиралей. Подобная тенденция выявлена и для других трансмембранных сегментов интегральных белков, особенно транспортных. Значение этого феномена неизвестно. Следует отметить, однако, что из-за наличия циклической боковой цепи пролин не образует водородных связей с остатками, находящимися на предыдущем витке а-спирали. Это может способствовать формированию структур, в которых водородная связь образуется за счет специфичного взаимодействия с остатком, расположенным в другом пронизывающем мембрану участке. Подобное полярное взаимодействие внутри бислоя могло бы стабилизировать трехмерную структуру мембранных белков.
Способы идентификации первичных амфифильных структур
Однозначная структурная информация о мембранных белках получена лишь в нескольких случаях, но зато в распоряжении исследователей имеются обширные данные об аминокислотной последовательности, основанные на результатах секвенирования ДНК. Для идентификации трансмембранных а-спиралей, предположительно имеющих длину - 20 остатков и состоящих преимущественно из гидрофобных аминокислот, разработано несколько методов анализа аминокислотной последовательности. В основе каждого из них лежит расположение аминокислот в ряд в соответствии с неким параметром, который отражает вероятность обнаружения этого остатка в трансмембранном сегменте.
Существует два типа шкал. В одном случае аминокислоты классифицируют по их относительной полярности или «гидрофобности». Эти шкалы имеют термодинамическую природу и основаны на величине изменения свободной энергии при переносе аминокислоты из водного раствора в углеводородную среду. Однако число способов количественной оценки гидрофобности аминокислот весьма велико, и они не во всем согласуются между собой. Часто используются данные, относящиеся одновременно к более чем одной физической характеристике. Примером такого рода является шкала «гидропатии» Кайта и Дулиттла, основанная на данных о гидрофобности, измеряемой по потенциалу гидрации, а также о вероятности нахождения остатков внутри глобулы.
Шкала Голдмана, Энгелмана и Стейца основана на количественной оценке свободной энергии переноса а-спиралей из водной среды внутрь мембраны. На рис. сравнивается шкала Кайта - Дулиттла со шкалой Голдмана-Энгелмана-Стейца.
По оценка Энгелмана и др., изменение свободной энергии при внедрении в мембрану полианионной а-спирали длиной 20 остатков составляет 30 ккал / моль. Расчет основан на оценке площади поверхности спирали, экспонированной в растворитель. Вклад в энергию каждой боковой группы оценивали с учетом площади поверхности, экспонированной в водную среду внутри спирали. Учитывали также свободную энергию переноса в бислой полярных групп. Например, предполагали, что глутамин при переносе в бислой будет протонироваться и свободная энергия этого процесса составит 10,8 ккал / моль. Подобно этому, перенос гидроксилов будет «стоить» примерно 4,0 ккал / моль.
Все сказанное выше показывает, как выигрыш в энергии взаимодействий при переносе а-спирали внутрь бислоя может использоваться для «втягивания» в бислой полярных боковых групп. Например, один остаток аргинина может встроиться в бислой в составе неполярной трансмембранной спирали, если он депротонирован; для этого требуется 16,7 ккал / моль при рН 7,0. Суммарная свободная энергия переноса а-спирали по-прежнему останется отрицательной. Однако ситуация изменится, если в бислой понадобится встроить два аргининовых остатка или если аргинин будет положительно заряжен. Конечно, полярные остатки могут стабилизироваться внутри бислоя благодаря специфическим взаимодействиям, но реально учесть это при расчетах очень трудно. Например, боковые группы серина, цистеина и треонина могут образовывать водородные связи с полипептидным остовом, а кислые и основные остатки могут образовывать ионные пары; появление таких пар возможно, если эти остатки расположены через четыре или пять мономерных единиц друг от друга.
Второй тип шкал, который используется для классификации аминокислот, основан на данных о частоте, с которой аминокислоты действительно встречаются в пронизывающих мембрану сегментах.
При этом эмпирически учитывается гидрофобность, а также многие другие факторы, которые нельзя оценить количественно, как гидрофобность. Недостаток этого полуэмпирического подхода состоит в отсутствии точных данных о границах трансмембранных участков. Тем не менее подобные шкалы могут быть столь же полезны, как и шкалы, основанные на термодинамических параметрах. В качестве примера можно привести шкалу «склонности» к мембране Куна и Лейгха или шкалу «погруженности спирали в мембрану» Рао и Аргоса. Четыре наиболее гидрофобных остатка по шкале Голдмана-Энгелмана-Стейца являются также четырьмя остатками с наивысшим значением параметра по шкале Рао и Аргоса.
На рис. представлены профили трех разных мембранных белков, полученные с использованием различных шкал. При построении этих профилей учитываются средние значения чисел на шкалах, приписываемые каждой аминокислоте в пределах выбранного «окна»; это среднее откладывается относительно номера остатка в полипептиде. Например, если «окно» составляет 19 остатков, значение, приписанное положению 40, будет средним числом на шкале для всех аминокислот от 31 до 49 включительно. Значение, приписанное положению 41, будет средним для остатков с 32 по 50 и т.д. Пики на профиле соответствуют гидрофобным участкам или тем участкам, которые с большей вероятностью образуют трансмембранные спирали. Для построения профиля важен размер окна; большинство кривых на рис. были построены при размере окна в 19 остатков.
Попытаемся проинтерпретировать построенные профили. По шкале Голдмана-Энгелмана-Стейца пики при значениях, близких к нулю, соответствуют трансмембранным спиралям. Значение 1,25 по шкале Кайта-Дулиттла является наименьшим значением, отвечающим известной трансмембранной спирали в L-субъе-динице реакционного центра R. viridis. Во всех трех случаях, представленных на рис. 3.12, профили для субъединиц реакционного центра сходны.
На рис. приведены два профиля для цитохрома Р450 из микросом. Этот белок был выбран потому, что данные о его первичной структуре позволяют высказать предположение о наличии у него восьми трансмембранных спиралей. Однако имеющиеся экспериментальные данные указывают на существование только одного N - koh - цевого якоря в мембране. Как профиль Кайта-Дулиттла, так и профиль Голдмана-Энгелмана-Стейца выявляют N-конце-вой участок, но они указывают и на наличие одного или более дополнительных трансмембранных сегментов, что не соответствует действительности. Отметим, что многие из построенных моделей мембранных белков, которые основываются лишь на данных об аминокислотной последовательности, могут быть некорректными.
На рис. приведены три профиля для бактериородопсина. Несмотря на их сходство, видны различия в форме пиков, отвечающих семи трансмембранным сегментам. Алгоритм Голдмана-Энгелма-на-Стейца не учитывает стабилизирующего эффекта, связанного с образованием ионной пары из близко расположенных заряженных остатков в пределах одной спирали. С учетом этого фактора разделение между двумя последними спиралями становится более четким.
Одна из проблем, с которыми сталкивается применение всех описанных выше алгоритмов, состоит в том, чтобы исключить гидрофобные сегменты в известных глобулярных белках, не являющиеся трансмембранными, но располагающиеся внутри белка. Однако, когда мы ищем достаточно протяженные участки, эта проблема не возникает.
Отметим, что алгоритмы, используемые для выявления а-спиральных структур в растворимых глобулярных белках, например алгоритм Чоу-Фасмана, непригодны для обнаружения трансмембранных элементов. Эти алгоритмы неприменимы для описания структуры неглобулярных участков, какими являются сегменты, расположенные внутри бислоя.
Алгоритмы, предназначенные для идентификации трансмембранных участков, нельзя использовать в случае сегментов, являющихся вторичными амфифильными структурами или пересекающих мембрану в виде /3-слоя. В первом случае этот участок исключается из рассмотрения из-за наличия в нем полярных остатков, а во втором трансмембранный сегмент оказывается слишком коротким, поскольку для пересечения бислоя необходимо лишь 10-12 аминокислотных остатков в составе /3-структуры. Некоторые алгоритмы предназначались скорее для выявления ^-поворотов, а не самих трансмембранных элементов. Хотя это позволяет избежать некоторых проблем, связанных с выделением различных классов трансмембранных элементов, неясно, насколько приемлемыми они окажутся при более широком их применении.
Способы идентификации вторичных амфифильных структур
Разработано несколько подходов к выявлению вторичной амфифильности или асимметрии в распределении гидрофобных остатков в сегментах полипептидной цепи. Достаточно часто а-спирали и /3-слои в глобулярных белках характеризуются периодичностью в распределении гидрофобных остатков. Использование спирального кольца как качественного показателя не всегда оправданно, необходимы более количественные подходы. Основной из них - это определение периодичности в распределении гидрофобных остатков с помощью методов фурье-преобразования. В качестве примера можно привести гидрофобный момент.
1. Гидрофобный момент. Этот параметр был предложен Эйзенбергом и др. Он определяется как
и представляет собой некую векторную сумму гидрофобности остатков в сегменте из N элементов. Гидрофобность каждого остатка представлена в виде вектора, который характеризуется углом, образуемым боковой цепью и осью полипептидного остова. Для а-спирали 6 = 100°. На рис. 3.9, Б «векторы» гидрофобности представлены в проекции на плоскость спирального кольца, и гидрофобный момент равен их векторной сумме. Гидрофильный остаток представляется вектором с отрицательной направленностью. Для случайной последовательности значение ци в силу случайного распределения гидрофобных остатков будет очень мало. В то же время в пептиде меллитине гидрофобные остатки расположены с одной стороны структуры, а полярные - с другой. Численное значение гидрофобного момента приписывается аминокислоте, находящейся в центре анализируемого сегмента. Следовательно, можно «просканировать» последовательность и приписать каждому положению среднюю гидрофобность, а также найти ^н-
Эйзенберг и др. проанализировали сегменты длиной 11 остатков из многих белков и пептидов, определив гидрофобный момент
и среднюю гидрофобность для каждого из исследуемых сегментов. Для полипептидных сегментов глобулярных белков характерны низкие значения как, так и ци - Трансмембранные элементы гидрофобного характера имеют высокие значения, но низкие значения рн, являясь в основном неполярными. Пептиды и участки белков, относящиеся к «поверхностно-активным», имеют высокие значения цн из-за сильной асимметрии в распределении полярных и неполярных остатков. С помощью этого алгоритма были идентифицированы некоторые сегменты поверхностно-активных белков, например участки дифтерийного токсина и пируватоксидазы из Е. coli.
Гидрофобный момент служит количественной мерой периодичности в распределении гидрофобных остатков в разных участках полипептида. Важную роль при этом играет выбор 6. Гидрофобный момент является по существу одним из параметров фурье-преобразования функции гидрофобности. Более общие методы, описанные ниже, позволяют проанализировать все фурье-компоненты и выявить любую возможную периодичность.
2. Периодичность последовательности. Разработано много методов идентификации участков белковых молекул, для которых характерны периодические изменения гидрофобности вдоль цепи. Все они включают фурье-преобразование функции, зависящей от гидрофобности аминокислотных остатков вдоль полипептида. Наличие пика с периодом 3,6 указывает на то, что гидрофобный остаток в данном сегменте анализируемого полипептида встречается в среднем через каждые 3,6 остатка. Это означает, что сегмент является а-спиралью, на одной стороне которой находятся преимущественно гидрофобные остатки. Этот метод использовался для идентификации амфифильных участков в некоторых траспортных белках и белках, образующих каналы; в качестве примера можно привести ацетилхолиновый рецептор, натриевый канал, переносчик глюкозы, белок-разобщитель митохондрий и белок полосы 3 эритроцитов, являющийся анионным переносчиком. Однако четкие указания на то, что эти предполагаемые амфифильные спирали являются трансмембранными, отсутствуют.
Эти методы использовались также для анализа пептидов, взаимодействующих с мембранной поверхностью, и аполипопроте-инов.
Пептиды - модели мембранных белков
Пептиды стали использоваться для изучения белково-липидных взаимодействий много лет назад. В большинстве случаев это были природные мембраноактивные пептиды, в первую очередь грамицидин А, аламетицин и меллитин. В настоящее время в качестве модельных систем чаще применяют синтетические пептиды. При этом необходимо помнить о двух моментах: 1) при связывании пептида с мембраной существенны как первичная, так и вторичная амфифильности; 2) пептиды часто обладают полиморфизмом, т.е. способностью изменять конформацию в зависимости от окружения. Не; исключено, что в будущем с помощью синтетических пептидов удастся детально изучить белково-липидные взаимодействия, но пока мы еще очень далеки от этого.
